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  • 培養基的質量控制與保存

    發布時間:

    2022-12-27

    作者:


    一、物理性狀的質量控制
    應包括20℃ -25 ℃時的pH,并應觀察以下內容:加入的量和(或)瓊脂層的厚度、顏色、透明度、是否存在肉眼可見的雜質、凝膠穩定性/黏稠度(一致性)、濕度。
    滅菌前后都應測定pH,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養基的pH,固體培養基可用平頭電極或者連接微型探頭的電極測定pH,測量時盡量使溫度降到20℃-25 ℃,校正通常用接近40 g/L的氫氧化鈉或者1 mol/L的鹽酸。
    二、微生物的質量控制
    1.污染檢測
    在每批制備好的培養基中應當選取部分樣品進行污染測試。
    2.質控菌株
    質控菌種應具有穩定特性,能代表其種并能有效地證明實驗室特定培養基的最佳性能。測試菌種應可溯源至國家或國際公認的菌種收藏中心,也可以是實驗室自己分離的具有良好特性的菌種,但必須對照標準菌株進行鑒定。實驗室應檢測和記錄儲存菌株(stock culture)的相關特性,新復蘇的菌種可能會有非特異性反應。最好使用從食品中分離的菌種。
    質控菌種應具備以下性能:具典型反應的強陽性菌種;弱生長的陽性菌種(選擇更敏感的菌種);無生化反應的菌種;完全抑制菌種。
    3.質控方法
    國際食品微生物委員會和培養基菌種衛生工作組(WPCM)介紹了評估用測試菌種的有效收集方法。
    (1)即用培養基和試劑
    商品化的生產廠家如果經過IS0 9001和ISO 9002體系認證或滿足相應質量要求,應向使用方提供資質證明。這時,使用者就不必對培養基進行大量的測試工作,但必須保證其儲存條件。
     
    (2)采用商品化合成脫水制備的培養基
    按ISO/TS 11133-1: 2009 《食品和動物飼料的微生物學 培養基制備和生產指南第1部分:實驗室培養基制備質量保證通則》的要求,除了對每批制備好的用標準菌株進行測試外,還應用實際樣品進行檢測,以更好地保證質量。對于不含指示劑或選擇劑的,只需用陽性測試菌種進行測試。對于含有指示劑或選擇劑的,必須使用能證明其指示或選擇作用的菌種進行試驗。對于復合培養基,即需要加入添加成分的培養基,要用具備上述性能的菌種逐批進行檢驗。對實驗室制備的需加入添加成分的制成培養基同樣適用。
    (3)按照配方制備的
    建議除了按照上述方法進行培養基品質測試外,還要用改良的Miles-Misra技術、螺旋平板技術或菌落總數技術進行測試,以監控基礎材料的質量、性能和實驗室內部的配制規范。實際上,食品中包含有應激反應的微生物,還應考慮到培養基在應激細菌恢復方面的適用性。
    三、性能測試方法
    實驗室可采用半定量和定量技術對固體、液體培養基的性能進行測試,在多數情況下能滿足對性能測試的要求。
    對于特殊情況,如評價一種新的培養基或一個新的生產商的產品等,應采用定量測試法。
     
    應用于固體培養基質控程序的技術大都依靠菌落計數。主要應用的技術有:傾注法、涂布法、旋轉涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。這些方法作為食品實驗室的日常方法得到了國際公認。由于傾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中經常使用,這里不再介紹,著重介紹一下改良的Miles -Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。
    (1)改良的Miles-Misra方法
    改良的Miles-Misra方法是通過測試生長率(productivity ratio, PR)來檢查性能,通常與對照培養基相比。富含營養物質的培養基,如:胰酪胨大豆瓊脂。
    該方法步驟如下:
    ①將試驗菌株的過夜培養物用緩沖蛋白胨水10倍梯度稀釋。
    ②將試驗和對照培養基做成4 mm厚的平板,并使平板表面干燥。
    ③從最高稀釋度(如10-5)開始,分別滴1滴稀釋液于試驗平板和對照平板標記好的區域。
    ④每個稀釋度各取4滴分別加入4個試驗和對照培養基,每1滴的涂布超過四分之一平板,并用涂布器從高稀釋度開始涂布, 37 ℃培養18h。
    ⑤對數量和菌落形態進行評價。
    評價方法,即按下列方式計算:
    PR=Ns/No
    式中:
    PR--生長率;
    Ns-試驗培養基的菌落數;
    No-對照培養基的菌落數。
    示例:在10-3稀釋度,試驗培養基上為20個菌落,對照培養基上為25個菌落,則PR=0.80。
    (2)半定量劃線法
    使用本方法時,所有測試培養基應干燥到相同程度,且整個步驟應標注化,以便于比較同批次的測試結果。
    用1 uL接種環劃線平板。在A區用接種環按0.5 cm的間隔劃4條平行線,按同樣的方法:B區和C區劃線,最后在D區內劃一條線。按標準方法所規定的培養時間和溫度進行培養。
    通常情況下用同一接種環對A區~D區進行劃線,在不同區域劃線時不需對接種環滅菌。但為了得到低生長指數G1, ,在A區和B區接種應更換接種環或對其進行滅菌。
    評價方法:培養后,評估菌落的形狀、大小和密度,并計算生長指數G1。每條有菌落生長的劃線記作1分,每個培養皿上最多為16分。如果僅一半的線有菌落生長,記作0.5分。如果劃線上沒有菌落生長或生長量少于劃線一半,則記作0分。記錄每個平板的得分總和便得到G1。例如:菌落在A區和B區全部生長,而在C區有一半線生長,則G1為10。
    目標菌的生長指數G1大于6時,則判定培養基可接受。非選擇性培養基的G1值通常更高。目標菌應呈現典型的生長,而非目標菌的生長應部分或完全被抑制。
    (3)定性劃線法
    該方法只是定性測試,劃線培養后,按照要求進行打分,得分是指示性的,可用作固體培養基性能測試的補充。
    取1uL測試菌株培養物在測試培養基表面劃平行直線,可同時在一個平板上接種多個菌株,但劃線不能交叉,然后按標準方法中的培養時間和溫度進行培養。
    評價方法:培養后按以下方法進行平板生長評估: 0表示無生長, 1表示生長, 2表示良好生長。目標菌得分應為2,并且有典型的菌落外觀、大小和形態。非目標菌的生長應該部分或全部被抑制。
     
    為確定生長率,應接種適當的培養物。下面介紹的是用定量、半定量和定性方法評估生長率和選擇性的方法。所推薦的這些方法都是通過將液體培養基以傾注或劃線方式接種到瓊脂平板上培養后,計數或計算液體培養基分數而得出其生長數量的。對于定性測試方法,則通過肉眼觀察來實現。
    目標菌和非目標菌的定量稀釋法步驟如下:
    選擇液體培養基10 毫升/管待檢。
    接種目標菌:將少量測試菌株培養物(每管10 CFU~100 菌落形成單位CFU)接種測試肉湯和標準肉湯,混勻。
    接種非目標菌:將大量測試菌株培養物(每管大于1000 CFU)接種測試肉湯和標準肉湯,混勻。
    接種目標菌和非目標菌的混合培養物:用少量目標菌(每管10 CFU ~100 CFU)測試肉湯和標準肉湯。同時每管接種大量非目標菌(每管大于1000 CFU),混勻。
    稀釋劑和運輸培養基中目標菌和非目標菌的接種:接種測試菌于稀釋劑中(每管100 CFU~ 1000 CFU),混勻。
    按標準方法中的培養時間和溫度進行培養。
    結果的計算和解釋:
    (1)計算目標和非目標微生物的菌落數,用生長率(PR)和選擇因子(SF)進行結果的解釋。
    目標微生物的PR不應小于0.1 (因生長的不同不能超過1個數值),非目標微生物的SF至少應達到2。
    SF的計算見式 :
    SF=Do-Ds
    式中:
    Do-在參考培養基上能生長至少10個菌落的最高稀釋度;
    Ds-在測試培養基上顯示相應生長的最高稀釋度;
    SF、Do和Ds用Ig表示。
    例如:Do=lg104=4.0, Ds=lg103=3.0,選擇因子SF=1.0。
    混合菌株中, 目標菌的生長不應受到非目標菌的抑制,即目標菌始終應為優勢菌群。
    (2)在混合菌株中目標菌數量的最低值及非目標菌數量的最高值應符合以下要求:目標菌的最低濃度應達到10CFU/毫升 ~10CFU/毫升;在選擇性肉湯培養物中非目標菌的最高濃度不應超過104 CFU/毫升.
    (3)稀釋和運輸培養基不應引起目標菌和非目標菌數量的減少或增加。菌株在這些培養基中培養后的數量變化應在最初計數的±50%的范圍內。
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