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  • 菌種保藏技術:真空冷凍干燥法

    發布時間:

    2022-12-27

    作者:


    菌種保藏技術:真空冷凍干燥法

     
    將微生物冷凍,在減壓下利用升華作用除去水分,使細胞的生理活動趨于停止,從而長期維持存活狀態.
    操作步驟如下:
    好氧菌冷凍干燥管的制備
     
    步驟1:安瓿管準備
    安瓿管材料以中性玻璃為宜.清洗安瓿管時,先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標簽,標上菌號及時間,加入脫脂棉塞后,121下高壓滅菌15-20分鐘,備用.
     
    步驟2:保護劑的選擇和準備
    保護劑種類要根據微生物類別選擇.配制保護劑時,應注意其濃度及pH值,以及滅菌方法.如血清,可用過濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用.
     
    步驟3:凍干樣品的準備
    在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期,進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行)),與保護劑混合均勻,分裝.微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/毫升為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支).采用較長的毛細滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個球部.若是液體培養的微生物,應離心去除培養基,然后將培養物與保護劑混勻,再分裝于安瓿管中.分裝安瓿管時間盡量要短,最好在1-2小時內分裝完畢并預凍.分裝時應注意在無菌條件下操作.
     
    步驟4:預凍
    一般預凍2小時以上,溫度達到-20到-35左右.
     
    步驟5:冷凍干燥
    采用冷凍干燥機進行冷凍干燥.
    將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內,開始冷凍干燥,時間一般為8-20小時.
     
    步驟6:真空封口及真空檢驗
    將安瓿管頸部用強火焰拉細,然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封.
    熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度.
     
    步驟7:保藏
    安瓿管應低溫避光保藏.
     
    步驟8:質量檢查
    冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查,如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等.
    厭氧菌冷凍干燥管的制備
    主要程序與需氧菌操作相同,注意保護劑的選擇和準備,保護劑使用前應在100的沸水中煮沸15分鐘左右,脫氣后放入冷水中急冷,除掉保護劑中的溶解氧.
     
    復蘇方法
    先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,
    將安瓿管頂部燒熱,
    用無菌棉簽沾冷水,在頂部擦一圈,頂部出現裂紋,用挫刀或鑷子頸部輕叩一下,敲下已開裂的安瓿管的頂端,用無菌水或培養液溶解菌塊,使用無菌吸管移入新鮮培養基上,進行適溫培養.
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