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  • 大腸菌群平板計數法常見問題分析

    發布時間:

    2022-12-27

    作者:


    大腸菌群平板計數法常見問題分析

    1、VRBA培養相關問題
    問題:所用器皿是否需要滅菌?
    答復不需要.配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌,但要求一定要清洗干凈,表面無污漬、無殘留.煮沸完成后,取下錐形瓶,用一般常用的衛生紙(軟紙)覆蓋瓶口,用橡皮筋纏繞,待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基.在傾注培養基時,須點燃酒精燈,稍微灼燒錐形瓶口.
    問題:如何保持“煮沸2分鐘”?
    答復可以用電磁爐或電熱板進行加熱煮沸,在該培養基即將煮沸時調低溫度.實際操作時,不需要嚴格按照此要求進行,加熱煮沸數秒即可.原因:本培養基很難保持煮沸2分鐘,一旦煮沸,則培養基很快上涌、翻騰,若不調低溫度或立刻采取其他措施,則培養基可在數秒內噴涌出來,嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1至2米范圍內都是培養基飛濺的范圍(實驗室危險因子之一).
    問題:若培養基未用完,是否可以冷藏起來下次用?
    答復不可以.4789.28中已規定,固體培養基最多允許熔融1次(指的是經過高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用).且VRBA培養基冷卻后,再次熔融時非常容易噴涌,若溫度控制不當,底部培養基熔融后很快就會發生噴涌(即培養基未完全熔融就會發生噴涌現象).
    結晶紫中性紅膽鹽瓊脂的圖片
    問題:傾注完成后是否需要“覆蓋一層”?如何覆蓋?
    答復一般情況下不需要覆蓋.在實際操作過程中,若檢驗員初次接觸該食品(或食品品類),則有必要在傾注培養基后再覆蓋一層(原因是不清楚該樣品是否會發生蔓延).而如此往復測試幾次后,若該樣品或食品品類均不存在蔓延現象,則以后的實驗中都不需要進行覆蓋.若重復多次測試后都有蔓延現象,則以后的檢驗中最好都進行覆蓋,最好是在原培養基已凝固或半凝固(不會發生晃動)時再傾注一層培養基(“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個平皿).
     
    問題:如何確定培養基上長的是不是大腸菌群?
    答復建議新手們認真按照標準進行證實試驗,此證實試驗簡單易操作,每一次VRBA上有菌落生長都進行證實試驗,如此往復3-4次,對于哪種形態才是大腸菌群已經能夠了然于心.
     
    問題:兩個梯度都長了菌,如何選取?
    答復選取15-150CFU之間的平板(指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍),挑取可疑菌落進行證實試驗.詳細舉例說明:若有兩個連續梯度的4個平板上菌落數均在15-150之間,則4個平板上的菌落都要挑取進行證實試驗,實際操作時,可靈活操作,如:1:10的兩個平板上的菌落數分別為120、123,1:100的兩個平板的菌落數分別為16、18,嚴格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進行證實試驗,如此需要40根GBLB肉湯管.建議使用鎳合金接種環(即傳統的接種環,而不是一次性塑料接種環),因為VRBA上生長的菌落(無論典型或可疑)大部分長在底層、且菌落一般較大,被培養基覆蓋,傳統的接種環較細,用以刮去上層培養基較方便,挑取菌落也較方便.
     
    問題:如何進行證實試驗?菌落選取數量?
    答復同上所述,建議新手們VRBA上的所有不同形態的菌落都進行證實試驗.每種不同形態都挑取5-10個進行證實試驗(若BGLB管足夠,建議多挑取幾個進行試驗).
    注意:A.每種可疑菌落挑取5個,每個菌落放入1管GBLB管中;B.“產氣者,記為大腸菌群陽性管”,就要求在實驗前須認真篩選BGLB管,凡產氣的GBLB管應棄去不用.
     
    問題:結果如何計算?
    答復首先,在VRBA培養24h后進行計數,分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群(何為可疑、何為典型?同“2”,檢驗員多進行幾次實驗后自然很清楚典型的大腸菌群是何種形態)的數量.假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個,典型大腸菌群有6個;其次,進行證實試驗,挑取上述可疑和典型大腸菌群各5個(或者全部挑取),假如10個可疑大腸菌群中有3個證實為陽性,6個典型大腸菌群中有5個證實為陽性,則計算方法如下:最終大腸菌群數=經證實的大腸菌群數=可疑大腸菌群經證實的數量+典型大腸菌群經證實的數量=10×(6/10)×10+6×(5/6)×10=110.
    問題:若平板上很多菌落,最終證實全部為陰性,結果如何計算?
    答復根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進行證實試驗,若證實全部為陰性,則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落(建議可疑和典型菌落分別挑取10個)進行證實試驗,若第二次證實試驗均呈陰性,以<1乘以最低稀釋度進行計算,如:1:10的平板菌落數分別為120、123,1:100的平板上菌落數分別為16、18,首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若全部為陰性,再挑取1:10的兩個平板上的菌落進行證實試驗,若1:10的平板上的菌落數證實為陰性,則最終計算過程為<1x10,最終結果為<10;若1:10的的平板上的菌落有陽性管,則按照第5條進行計算.
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