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  • 日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析

    發布時間:

    2022-11-16

    作者:

    日水培養基


    生物藥工業化生產中,生長培養基配方中通常含酵母提取物和蛋白胨等添加物。盡管政策鼓勵公司使用化學限定性培養基以減少哺乳動物細胞培養工藝中的變量,許多微生物和哺乳動物細胞培養工藝中仍繼續使用生物添加物作為其生長培養基配方或補料。據Sheff ield Bioscience (Kerry, Inc.)報道,已獲批的哺乳動物細胞–衍生的生物治療產品中至少有六成在生產中使用了生物添加物。
     
    工藝開發過程中,難以確定哪種添加物適合于某種特定應用,因為添加物的復雜組分和多樣性。多變量分析(MVA)技術越來越廣泛地應用于幫助公司了解他們的生物制藥產品和生產工藝的復雜性。  
     
    技巧包括基于統計的工藝建模、傳感器校準和工藝可比性。
     
    多變量分析(MVA)技術本質上是一種統計回歸技術,試圖通過捕捉新的正交變量或稱為主成分(PCS)的可變性來對實際變量的可變性作出解釋。相關實際變量之間的相關性允許使用數量較少的主成分來捕捉建模和作出預計,從而對更大量的數據集的原始信息作出分析。
     
    這里,主成分分析法(PCA)用于對來自六十五種無動物成分(ACF)生物添加物的組合數據變化,進行數據捕獲和建模。由此產生的模型用于研究兩種生物添加物的批間變化,并對市場上的新產品進行評估。本文展示定量結構-活性關系(QSAR)方法來研究組分與培養表現和產品蛋白含量之間的關系。 
     
    這里推薦定量結構-活性關系(QSAR)為基礎的方法,使用主成分空間的因子設計來評價添加劑組成和細胞培養表現之間的聯系。由生物添加物衍生的主成分分析法(PCA)分數和由定量結構-活性關系(QSAR)方法選擇出來的生物添加物的細胞培養物的模擬性能數據組成的訓練集,被用來創建偏最小二乘(PLS)模型。然后PLS模型可以用于預測不屬于訓練組的生物添加物的性能。
     
    數據源和數據匯編
    145個生物添加物的化學成分數據,可從公開來源獲得,由OxoD,Becton Dickinson和Sheff ield Bioscience公布。
     
    這些數據代表了每種生物添加物的典型組成,并且可以被認為是從許多生產批次、子樣本或分析中得出的平均值。每個生物添加物的化學組成在電子表格中被編輯并注釋以方便后續的分析。注釋里包含供應商、原材料來源、產品類型、消化法和ACF狀態(表1)。在供應商之間的測量單元不同的情況下,這些測量單元被標準化,使得數據集具有可比性。選擇65個無動物成分(ACF)生物添加物組成的訓練數據集,每個數據集有59個變量來描述每種生物添加物的物理化學數據、分子量分布和自由氨基酸總量。表2列出了這里使用的變量。 
    分析方法
    使用SIMCA P 11.5(MKS UMeMeX,瑞典)用于錯誤篩選、PCA和PLS分析。從編譯數據集中選擇ACF生物添加物以構建PCA模型。80%以上的產品的變量可用于分析。在分析前用中間定心和單變量定標對所有變量進行預處理。
     
    結果
    1市售無動物成分(ACF)的主成分分析(PCA)
    生物添加物:總計59個變量被用來描述每種無動物成分(ACF)生物添加物(共計65種),以建立主成分分析模型。結果模型捕獲了67%的數據集變動,來自于四個PCs。圖1顯示了PCs 1, 2和3的分數曲線。這些圖顯示了添加劑組分之間的關聯。在左側,酵母提取物傾向于與ACF共混物沿著PC1(X)軸分離,而ACF共混物和大豆蛋白胨傾向于沿著PC2(Y)軸分離。在右側,大豆蛋白胨和ACF共混物傾向于沿著PC3(Y)軸分離。
    日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析
    圖2顯示了PC1/PC2(左)和PC2/PC3(右)的加載圖,總結了PC1和PC3之間原始組成變量的關系。可變標記根據可變類型著色:生理化學(CHE);游離氨基酸(FAA);分子大小分布(SIZ);和總氨基酸(TAA)。PC1與個別和總的游離氨基酸(FAA)呈正相關,與氨基氮百分比(%AN)呈正相關。中、高MW分布與PC1呈負相關。正如預期的那樣,更高的水解度(AN/TN)是與增加的低范圍MW種類和較高的游離氨基酸(FAA)含量相關。如圖1的左側面板所示,酵母提取物傾向于沿PC1與ACF共混物分離,表明酵母提取物是與較高氨基氮百分比(%AN)和游離氨基酸(FAA)相關,具有較低范圍的MW種類。PC2與總氨基酸(TAA)呈正相關,PC3與中范圍MW種類增加相關,與低范圍MW種類呈負相關。ACF共混物和大豆蛋白胨是沿著PC2分布,表明變化的主要原因是由于總氨基酸(TAA)含量的變化。大豆蛋白與ACF共混物沿PC3分離,表明那些蛋白胨肽與中范圍MW種類的增加相關。
     
    2ACF生物添加物批量差異的PCA分析
    供應商網站提供的來自HyPep1510大豆蛋白胨和SHIFCHO PF ACF共混物組分的多批次數據。這些數據被編譯成如上所述的PCA模型。HyPep1510和SHIFCHO PF ACF共混物的批間比較數據被用作預測集,以比較在PCA模型中捕獲的典型參考數據。圖3比較每一個具有典型產品--參考數據(紅色圓圈)的產品批次的預測得分。因為預測得分在PCA模型的t-測試圓形范圍內,產品批次內的可變性被很好地建模。盡管所有批次都是在指定范圍內制造的,但大量的批間變化是清晰可見的。 
    日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析
    在圖3中,SHIFCHO PF批次被安排在一個不同的組中,在典型的參考數據(倒置三角形)下面。NVA #1165批次位于遠離主組的位置和典型的參考數據作為數據缺失的結果。剩余的批次沿著PC2(y)軸分布,表明總氨基酸(TAA)含量的一些變化。圖4左側面板顯示了組合批(NVA #1165除外)與典型參考數據批之間的差異,。不同的SHIFCHO PF批次的平均總氨基酸(TAA)含量比典型的參考數據顯示的總氨基酸(TAA)含量要低。特別地,SheffCHO PF批次通常具有較低的總谷氨酸、絲氨酸和纈氨酸,比典型參考數據報道中的總半胱氨酸含量更高。
    日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析
    圖4的右側顯示,與典型參考數據相比,半胱氨酸含量在所有批次中的含量都要大五倍多。從圖4的左側也可以清楚地看出,雖然典型參考數據和批次之間的差異是清楚的,但總的游離氨基酸(FAA)不變。
     
    圖3中,HyPep1510批被定位在一個單一的組中,其中包括典型的參考數據。該組沿PC1(X)軸分布,表明游離氨基酸(FAA)有一定的可變性。貢獻圖的研究比較了典型參考數據與HyPep1510批次的平均值之間的差異(圖5)。 
    日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析
    在圖5的左面板中繪制的貢獻權重在批次和參考材料之間沒有顯著差異。與參考物質相比,許多單個氨基酸的實際總氨基酸(TAA)含量減少。然而,在新的HyPep1510批次中,游離酪氨酸含量確實升高。圖5的右側顯示,與典型的參考數據相比,HyPep1510批次中游離酪氨酸含量是變動很大。在10個HyPep1510批次中,有六個批次顯示游離酪氨酸含量增加了兩倍多,與典型參考數據批相比。目前沒有關于使用這些批次的細胞培養增長和產率的數據,因此,無法確定多批次生物添加物中的變化是否具有生物學影響。批間生物添加物的變化,對哺乳動物細胞生長和單克隆抗體產率有很大影響。如果對多種生物添加物在多批次中的培養性能進行評價,就有可能預測批間變化對細胞培養生長和產率的影響。然后可以使用以下詳細描述的PLS建模技術,將成分變化與培養性能和/或產品質量屬性關聯起來。
    日水轉:培養基和補料中生物添加物的多元分析
    3商業化生物添加物的PCA分析
    隨著新產品不斷面市,生物添加物用于供應細胞培養和微生物發酵應用的商業市場是極具競爭力的。當供應商提供了足夠而適當的組成數據,這樣的新產品可以使用PCA模型進行快速比對。數據庫中,有Solobia生產的10種和Organotechnie 生產的13種添加劑添加劑的組成成分數據。單位已按材料和方法中的描述標準化。新的數據集被導入SIMCA,作為預測集與PCA模型比較。
     
    圖6是將新產品的預測得分與數據庫中所有145種產品的預測得分進行比較的3D圖。該圖顯示,在Hotelling T 2橢球區內捕獲了許多添加劑,包括新產品。許多位于 Hotelling T 2 區域外部的產品是動物來源,沿著PC1和PC2軸導出和分布。
    Organotechnie的產品位于 Hotelling T 2 區域,正如預期的那樣,主要包含非動物衍生產品。然而,Solobia的產品-馬鈴薯來源的蛋白胨和麥芽提取物-位于 Hotelling T 2 區域外,表明這兩種添加劑與其他添加劑有明顯不同。馬鈴薯蛋白胨與模型平均值(不包括在這里)比較,顯示馬鈴薯蛋白胨的較高總半胱氨酸和蘇氨酸的水平。這些差異是否轉化為生物影響尚待確定。
     
     
    4使用定量構效關系QSAR將生物添加物成分與培養性能聯系起來
    許多技術已被用于選擇和優化細胞培養和微生物生長培養基的生物添加物。有供應商報告了基于析因設計的培養基優化技術,已發展為市售工具包。本文推薦一種替代的多元建模方法,使用定量構效關系QSAR將生物添加物成分和培養性能聯系起來。QSAR已廣泛應用于藥物開發中,用于篩選肽類藥物。但據我所知,生長培養基的開發和優化是該技術的一種新應用。
     
    65 種ACF生物添加物的組成變化預先已在PCA模型中捕獲。主成分定義為正交,可用于析因設計實驗,每個主成分為一個設計因子。表3展示具有一個中心點的兩級三因子設計的設計點,其中每個因素都是來自主成分分析模型的主成分。每個設計點通過匹配其在PCA模型的主成分空間中的位置而與生物添加物相關聯。對于這種設計,不可能將中心點精確地與給定的生物添加物相匹配。然而,在PC3的中心點不匹配,這比PC1中變化的占比少得多,所以PC1不是關鍵的。
     
    模擬細胞培養性能數據被用來證明QSAR方法,因為在設計中單細胞系生長使用每個生物添加物的信息目前難以獲得。對于細胞培養實驗,QSAR方法假定類似濃度的生物添加物在接種前添加到基礎培養基中,或作為培養期間的補料。最終的產品濃度(蛋白含量)和完整活細胞(IVC)產出變量直接使用微軟Excel電子表格中的公式1和2從化學成分數據中模擬。在這些方程中使用的組成變量由化學成分數據集隨機生成。為簡單起見,蛋白含量和完整活細胞(IVC)均使用具有相同變量集的線性方程模擬,假設沒有變量交互。選擇每個變量的指標,以提供與已發表文獻中相似的蛋白含量和完整活細胞(IVC)值。通過以±10%標準偏差添加人工噪聲,產生每個輸出變量的一式三份。每個設計點的PCA得分和表4中的一式三份蛋白含量和完整活細胞(IVC)值被用于擬合PLS模型。得到的三要素模型里R2Y=0.9,Q2=0.81。
     
    圖7顯示了比較細胞培養性能數據和PLS模型對蛋白含量和完整活細胞(IVC)值的預測的等效圖。這兩個圖顯示出預測和模擬數據之間良好的一致性。等效圖中回歸系數(R2)的差異表明蛋白含量模型相關性優于IVC模型相關性。這些差異是成分變量的相對權重函數,用于模擬蛋白含量和完整活細胞(IVC)值。與PC1、2和3(圖2)強烈相關(負荷)的成分變量對蛋白含量和完整活細胞(IVC)值有很大影響。來自PCA得分值的PLS模型預測,而不是來自原始成分數據,證實了PCA模型從化學成分數據捕獲充分的信息以預測蛋白含量和完整活細胞(IVC)值的能力,源于QSAR方法且使用PLS模型。未被用作訓練集的一部分的數據庫里的剩余生物添加物,PLS模型可以用來預測其培養表現。
     
    圖8中的3D評分圖顯示了數據庫中,剩余生物添加物對應的蛋白含量和完整活細胞(IVC)值的預測的范圍。在這個例子中,PC1和PC2的陽性得分值更高的生物添加物,預計會有較高的目標蛋白含量和完整活細胞(IVC)值。
     
    MVA的一種新應用
    這項工作表明,PCA建模可以用來解釋,用于細胞培養或發酵培養基的ACF生物添加物的化學組成。在65類 ACF生物添加物的組成數據65%的變化可以用PCA模型來解釋。正如預期的那樣,PCA模型表明,生物添加物的成分主要在游離氨基酸(FAA)含量(PC1)中變化顯著。總氨基酸(TAA)含量在很大程度上獨立于游離氨基酸(FAA)含量,因為總氨基酸(TAA)參數與PC2密切相關,而游離氨基酸(FAA)與PC1密切相關(圖2)。評分圖表明,酵母提取物游離氨基酸(FAA)成分比ACF共混物蛋白胨游離氨基酸(FAA變化更大。這種差異反映了大豆蛋白胨生產過程中可以實現的更高程度的差異控制,比起使用酵母提取物。
     
    對Kerry Bioscience 生物添加物(Sheffield HyPep 1510 and SheffCHO PF)的多批次組成分析與PCA模型進行比較,該模型包含每個產品的典型參考數據(圖3)。雖然PCA模型很好地代表了這兩種產品的批次變化,當檢測數據與PCA模型進行比較時,還是發現一些批間差異。HyPep1510的典型參考成分代表了測試批次。在總氨基酸(TAA)變化和游離氨基酸(FAA)酪氨酸含量(圖5,左側)中發現了一些微小的差異,后者是典型參考成分(圖5,右)的兩倍。SheffCHO PF批次PCA評分與典型參考組分有一定差異,與典型組分分離(圖4,左)。這些小的差異歸因于總氨基酸(TAA)含量的差異,特別是總半胱氨酸、總絲氨酸和總氨基酸(TAA)。PCA模型確定批次數據中總半胱氨酸含量比典型參考數據大五倍(圖4,右)。因為游離氨基酸(FAA)含量和理化數據變化不大,鎖定在肽中的總氨基酸(TAA)含量差異的生物學相關性是未知的。其影響應取決于培養物分解多肽的能力,多肽分解能力依賴于細胞系和培養生長特性。
     
    PCA提供了一種簡單、直觀的方法來評估生物添加物的化學組成中的多元差異。它還允許快速識別大量批間差異的根本原因。確定觀察到的批次變異是否與生物學相關,需要額外的培養數據。類似的方法被用來評估批次差異和評估新產品的組成。這些新產品將包含在PCA模型訓練集的未來版本中。將Solobia和Organotechnie生產的新型生物添加物使用PCA模型進行了比較。正如預期的那樣,PCA模型很好地代表了許多新產品的預測得分。兩種產品(麥芽提取物和馬鈴薯蛋白胨)在PCA模型的 Hotelling T2 極限之外輕微下降,提示馬鈴薯蛋白胨一個很好的主題,來測試成分差異是否造成不同的培養行為。
     
    基于QSAR的方法可以將PCA模型中捕獲的化學成分數據與培養性能相聯系。由于PCA模型的軸是正交的,因此可以使用基于統計的析因設計實驗來評估代表訓練集的生物添加物的子集。PLS回歸模型被用于將PCA得分與模擬的培養性能相聯系。所得到的結果模型使得有可能確定產品差異或批次差異是否與被評估的細胞系生物學相關。
     
    為了將QSAR方法應用于新的細胞系,培養物可能生長在含有不同生物添加物的基礎培養基中。但是必須注意由于適應新的條件而不是生物添加物的影響而導致的改進。另外,添加劑的使用對培養性能的影響可以用一致的補料策略來評價。這種策略通常涉及在培養達到細胞密度峰值后每隔一段時間補料。然后可以在固定時間間隔往培養體系里添加由表3所示的生物添加物制成的固定量的補料。
     
    基于QSAR的每一個新細胞系的模型也將提供一個機會,快速評估剩余生物添加物在數據庫中的影響,以及細胞系是否具有確切的營養需求。
     
    為了簡化QSAR的這一應用,使用標準析因設計選擇了生物添加物的子集。有建議表明,標準析因設計不能有效地映射由PCA模型捕獲的多元空間。他們推薦使用D-最優實驗設計,可對多元空間提供更有效的覆蓋。這樣的設計使用計算機算法來從一組固定條件中選擇一個子集,來有效地覆蓋多元空間。此外,這種設計還可以適用于使用不同濃度的生物添加物。
     
    PCA用于分析從145個生物添加物較大的數據集里得到的65種ACF生物添加物的子集。已有更大的子集被分析,這里沒有報道。隨著新的生物添加物或額外的分析變得公開可用,數據集將每年更新一次。
     
    本文描述的方法可用于快速評估新的細胞系。細胞系在大多數商業可用生物添加物下的的性能可以被預測,通過使用大量減少的生物添加物的子集開展一系列實驗。該子集可以使用實驗設計(DOE)方法來選擇,例如析因設計或D-最優設計。隨著新的生物添加物的商業化可用,可以使用QSAR- PLS模型法快速預測細胞系的性能。
     
     
    參考來源:Ronan.D.O'Kennedy.Multivariate Analysis of Biological Additives for Growth Media and Feeds.      
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